2023年8月06日经国家标准化管理委员会,国家市场监督管理总局批准发布GB/T 13093-2023 《饲料中细菌总数的测定》标准,代替实施17年之久的GB/T 13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 。新标准将于2024年3月1日起正式实施。
GB/T 13093-2023标准历时3年,经过成立标准修改小组、搜集样品、确定实验方案、实验验证、意见征求、评审等,最终大功告成。
一、本标准与GB/T 13093-2006 相比,主要修订内容见表1:
表1:主要修订内容
二、主要修订内容实验分析综述
(一)培养基的确定
国内外标准用于测定细菌总数的培养基是平板计数琼脂培养基(PCA)和营
养琼脂培养基(NA)两种,我们对两种培养基的成分进行了比较,见表2。
国内外测定细菌总数测定的培养温度和培养时间,见表3。
表2 用于细菌总数测定的培养基
表3 国内外细菌总数测定用的培养基、培养温度、培养时间
从表2 中可以看出,PCA 里的胰蛋白胨比NA 里的蛋白胨是更优质的“食物”,葡萄糖更适合细菌生长。平板计数琼脂(PCA)生长的菌落不容易运动,不容易造成蔓延,无法计数的现象。
从表3 中可以看出,国内外除了我们现修订的饲料标准和环保行业的两个标准外,其余都是使用PCA 培养基。
两种培养基相同条件下和不同条件下的比较,见表4~表5。
表4 NA 和PCA 培养基相同条件下的比较
表5 NA 和PCA 培养基不同条件下的比较
根据表4来看,在相同条件下使用NA和PCA培养基的实验室结果,经过统计学的T检验分析,p=0.3917。根据这个结果可以得出结论,NA和PCA培养基之间的差异并不显著。
根据表5来看,在不同条件下使用NA和PCA培养基的实验结果,经过统计学的T检验分析,p=0.9296,根据这个结果可以得出结论,NA和PCA培养基之间的差异并不显著。
从以上结果可以看出,不管是方法相同和不同,差异都不显著(p>0.05),特别是不同的检测方法,差异更不显著(p=0.9296)。同时,在重复几百次试验后,PCA 培养基上细菌生长会更好,因平板计数琼脂(PCA)生长的菌落不容易运动,不容易造成蔓延,无法计数的现象。
再者说,GB 4789.2-2022《食品微生物学检验菌落总数的测定》、
ISO 4833-2013 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for theenumeration of microorganisms》的检测方法,以及AOAC、FDA、AS 等方法和国内进出口检验的方法,都是使用PCA 培养基。
所以,根据实验结果,以及参考其它行业国家标准,最终培养基修改为平板计数琼脂培养基(PCA),与国内外接轨。
(二)培养温度的确定
23 个不同种类样品的30℃和36℃培养温度进行实验比较,见表6
表6 PCA 培养基30℃和36℃
实验结果从表6中可以看出, PCA 培养基用30℃和36℃ 分别培养48 小时,70%的结果基本相同或高于30℃的结果;相对标准偏差RSD 在0%~2.5%之间;对两组数据进行了统计学的T 检验分析,p=0.1552,两者之间差异不显著;微生物细菌的生长温度也是36℃最为适宜;
同时GB 4789.2-2022《食品微生物学检验菌落总数的测定》,用36℃培养更加反应样品的菌落情况。考虑到大部分细菌(益生菌)都是用36℃温度培养,省去了检测单位培养箱的单独设置和检定。因此,本标准的培养温度也定为36℃。
(三)培养时间的确定
23 个不同种类的样品的培养时间的比较,见表7。
表7 PCA 培养基36℃,48h 和72h 比较
实验结果从表7中可以看出, PCA 培养基36℃ 分别培养48h 和72h 后,
两个培养时间的结果基本相同,对两组数据进行了统计学的T 检验分析,
p=0.7806,两者之间差异不显著。同时GB 4789.2-2022《食品微生物学检验菌落总数的测定》和进出口食品、AOAC 和FDA,都是36℃,培养48 h,
并考虑到时长和简便性。因此,本标准的培养时间也定为48 h。
(四)细菌总数的计算公式
原标准的计算公式是两个稀释度进行比较,若比值小于2取平均数,若大于2取稀释倍数低的。现依据统计学的原理,计算公式中增加了修正因子,国际标准和食品标准,更加合理和准确,并对不同含量和不同稀释度可能出现的结果给出了实例,便于操作者使用。
细菌总数的报告,增加了修约的描述,以及空白试验的要求。使操作者一目了然,更加合理,并规范了文本。
具体修改如下:
1.若只有一个稀释度平板上的细菌数在适宜计数范围内,计算两个平板细菌数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中细菌总数结果。
上述数据按9.2.2数字修约后,表示为16000或1.6×104。
2.若有两个连续稀释度的平板细菌数在适宜计数范围内时,按下列公式计算:
3.若所有稀释度的平板上细菌数均大于300 CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均细菌数乘以最高稀释倍数计算。
4.若所有稀释度的平板细菌数均小于30 CFU,则应按稀释度最低的平均细菌数乘以稀释倍数计算。
5.若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无细菌生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
6.若所有稀释度的平板细菌数均不在30 CFU~300 CFU之间,其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时,则以最接近30 CFU或300 CFU的平均细菌数乘以稀释倍数计算。
信息来源:食品伙伴网