01培养基的灭菌及使用

 

（1）每次配制时，要注意其生产日期是否在保质期内，查看其开瓶日期及瓶口密封性，保证其未变质，并且未吸潮。

（2）培养基配置时，称量要准确，包括盐水的分装要准确。

（3）一定要保证现配制现灭菌，未灭菌的配好培养基不能长时间放置，更不可隔夜。

（4）灭菌时要保证恒温、恒压，同时要保证有效灭菌时间。

（5）灭菌过的培养基要冰箱保存，可保存一周，一般不超过 3 天。而且要遵循“先入先出”原则，先配制的要先使用。

（6）在使用时，要根据当班次的使用量，用水浴锅先将培养基溶化为液态，然后及时调低水域温度（先化好的可从水域取出，放在水浴锅锅盖上）待用，千万不可长时间使培养基处于高温状态。

（7）做产品微生物检测时，倾倒培养基温度在 45℃左右，不可过烫，避免将菌烫死；也不可过凉，化好的培养基又结块凝固，不便于观察结果。

（8）每瓶培养基均要做空白。

（9）尽量集中做样，避免频繁打开同一瓶培养基瓶塞，增大培养基的污染几率，出现误差结果。

（10）培养基剩余过少时，可先将其倾倒成空白用板。

 

02做样环境的维持

 

（1）大环境（房间）

 

1）做样时，窗户和空调要关闭，或用酒精对房间进行喷雾消毒，避免房间内空气流通影响安全柜内部环境（最好在有通排风系统的恒温恒湿无菌间进行操作）。

2）如果在原来的原料微生物检测室进行做样，要定期开启紫外灯，对房间进行杀菌。

 

（2）小环境（生物安全柜）

 

1）工作前准备

a. 首先紫外灯照射30分钟

b. 关紫外灯，打开安全柜的日光灯和风机，用消毒剂对生物安全柜的内表面进行消毒擦拭

c. 将实验中需要用到的物品集中用消毒剂擦拭后放在台面相应位置上（切记勿阻挡风口！）

d. 等待5min，净化工作区的空气污染物

2）操作规范

a. 双臂垂直缓慢进入前面的开口，在生物安全柜中等待大约一分钟，以使安全柜调整完毕后才可对物品进行处理。

b. 所有操作应在离前窗10cm以外的工作区进行。

c. 废弃物应丢弃在生物安全柜内的处理容器中。

3）操作时注意事项

a. 双避免胳膊在前开口处快速移动和频繁进出

b. 尽量避免污染的物品进入洁净区

c. 避免使用明火干扰气流，可使用微型电加热器，最好使用一次性接种环。

d. 在生物安全柜内进行操作时，不能进行文字工作

e. 尽量减少操作者身后的人员活动。

 

4）工作结束后的要求

a. 将安全柜继续运行至少3min来完成“净化”过程

b. 将柜内物品移出前，应使用有效的消毒剂擦拭（特别是霉菌）

c. 每天实验结束后，对生物安全柜的内壁和台面进行擦拭

d. 等待5分钟后，关闭前窗，关灯，关风机，紫外灯照射30分钟

 

 

03工器具的洁净度

（1）玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌。

（2）做样用剪刀、勺子等物品要做到做样专用，不可与其它操作器具混用，使用时，先用75%酒精消毒，再采用灼烧方式进行灭菌。

（3）接种针（环）采用灼烧方式进行灭菌，但要注意做样时要先将接种针（环）进行冷却。

 

04样品的采集及检测

 

（1）保证采样器具的无菌性

1）玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌，保证恒温、时间足够（但不可时间过长，导致玻璃器皿易裂纹而报废）。

2）取样筐：使用前要用75%酒精进行喷洒消毒。

3）取样勺：要保证其清洁消毒，清洁后用75%酒精进行擦拭消毒。

4）取样袋：可先用酒精进行擦拭消毒，再在安全柜用紫外灯照射消毒，（包装车间要在传递窗用紫外灯照射消毒）。

5）电子称表面用 75%酒精消毒。

 

（2）人员操作

1）保证手部的清洗、消毒：取样前及做样前都要先洗手再消毒。

2）取样要具有代表性（随机样、目的样、综合样）且要标示清楚。

3）取样完毕，不可在车间逗留，要及时将样品放入安全柜，对其外表面进行紫外灯照射消毒。

4）在要求的做样区域进行操作。

5）做样前，要用 75%酒精棉球对样品袋口部进行擦拭消毒，再开口。

6）往盐水瓶加样品时，要注意勺子或袋子尽量不接触瓶口。

7）样品计量要准确，稀释倍数也要准确（1mL 吸管不允许将管口敲掉），进行 100 倍稀释时，1mL 吸管要伸入盐水中，不可以将样品从管壁流下去，同时要避免将管底部捅破。

8）盐水温度以 40℃左右为宜，不能过热，会将部分微生物烫死；也不能温度太低，不能将样品溶解完全。

9）进行稀释时，要摇匀，保证溶液的均一性。

10）倾倒平皿时，要注意培养基瓶口不要接触到平皿；倾倒的培养基要适量，不可以太少，在培养过程中干掉，微生物亦死亡，以 15mL 左右为宜。

11）做大肠菌群样时，要提前将乳糖胆盐培养基培养管按需要量备好，放入安全柜对外表面进行紫外线灭菌。

12）接二步时，要注意先将接种针（环）进行冷却，避免出现接不上菌落的情况发生，导致无法判断、确认。

13）做样完毕，及时放入相应培养箱进行培养，并清理清洁安全柜。

 

05微生物的培养

（1）在培养过程中，要随时监控培养箱温度，保证其在适宜的温度进行培养。

（2）要按照《微生物检验规范》要求及时观察结果，出现异常，要及时分析原因进行反馈。

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