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在实验室不学菌种保藏方法,怎么混?

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1、传代保存法:

有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时,会很快死亡,因此在这种情况下,只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存,它是最基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生产菌种的保存。传代保存时,培养基的浓度不宜过高,营养成分不宜过于丰富,尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种,则应在培养基中添加少量碳酸钙。  



一般地,大多数菌种的保藏温度以5℃为好,像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存,而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。传代培养保存法虽然简便,但其缺点也很明显,如:①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时,菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种,工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。

 

2、液体石蜡覆盖保存法:

该法较前一种方法保存菌种的时间更长,适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥,并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点,同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存,而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。

 

3、载体保存法:

即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种,如:



① 土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液,立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥,然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜,土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是:取适量土壤(5),置于塞有棉塞的试管中,加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜),然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种,培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止,移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封,冷藏或室温保存。



②砂土保存法:取清洁的砂,筛去掉大砂粒,并用磁铁吸去砂中铁屑,再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次,干燥后,置于试管或安瓶管中保持23cm深,再经干热灭菌后,加入1mL菌种培养液,经充分混匀后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂(HCl预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌,再进行菌种保藏。



③硅胶保存法:以616目的无色硅胶代替砂子,干热灭菌后,加入菌液。加菌液时,由于硅胶的吸附热常使温度升高,因而需设法加以冷却。 



④磁珠保存法:将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水

CaSO4),上铺玻璃棉,再放上1020粒磁珠,经干热灭菌后,接入菌悬液,最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效,特别适用于根瘤菌,可保存长达两年半时间。



⑤麸皮保存法:在麸皮内加入60%的水,经灭菌后接种培养,最后干燥保藏。



⑥纸片(滤纸)保存法:将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中,常压或减压干燥后,置于装有干燥剂的容器内进行保存。 

 

4、悬液保存法:

即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。

常用的有:

①蒸馏水保存法:适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌,将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。

②糖液保存法:适用于酵母菌,如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗处保存,可长达10年。除此之外,也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。  

5、寄主保存法:

即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。

6、冷冻保存法:

当采用这种保藏方法时,应注意以下几点

①要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞;

②要选择适宜的培养基,因为某些微生物对冷冻的抵抗力,常随培养基成分的变化而显示出巨大差异;

③要选择合适的菌液浓度,通常菌液浓度越高,生存率越高,保存期也越长;

④最好在菌液内不添加电解质(如食盐等)

⑤可在菌液内添加甘油等保护剂,以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样,也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂,但对有些微生物而言,不加保护剂时更有效。

⑥原则上应尽快进行冷冻处理,但当加入保护剂时,可静置一段时间后再进行处理。

⑦就动物细胞而言,应在-20℃范围内以1/min左右的速度缓慢降温,此后必须尽快降到贮藏温度;而对绝大多数微生物而言,则不必如此,如结构较为复杂的原虫则可在-35℃范围内进行缓慢降温,而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻;

⑧若进行长期保存,则贮藏温度越低越好;

⑨取用冷冻保存的菌种时,应采取速融措施,即在3540℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说,则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后,应尽量避免再次冷冻,否则菌体的存活率将显著下降。

 

常用的冷冻保存法包括
①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85)

低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便,也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多,有些可添加保护剂。此外,也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器内,再放入低温冰箱内进行保存的。

②干冰保存法(-70℃左右):即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存;

③液氮保存法(-196):是适用范围最广的微生物保存法。

 

其操作步骤如下:

a、装安瓶管:使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭菌溶液中,将0.21mL的这种溶液分装于安瓶中,或在装有分散剂的安瓶中直接接种,或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。

b、熔封安瓶管:若直接贮存于气相液氮中(-150-170)时,则不需熔封。

c、检查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下,将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡230分钟后,观察有无色素进入安瓶。

d、缓慢冷却:将熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮气以约1/min的速度冷却至-25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱内缓慢冷却3060min

e、速冷:最后浸入液氮中快速冷却至-196℃。 

 

7、冷冻干燥保存法:

在进行冷冻干燥时,需注意以下几个问题: 
a、冷冻干燥前的培养条件:首先检验菌种纯度。一般地说,将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;
为有芽孢或孢子的微生物,则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好,如细菌应达到1091010/mL

b、菌株号码等的标记:可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。  

c、安瓶的准备:将安瓶在2%HCl中浸泡过夜,自来水冲洗3次后,蒸馏水刷净,干燥,塞棉塞,贴标签,干热灭菌或温热灭菌后,60℃恒温干燥。

d、添加保护剂:常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等。甘油管保藏法:在5mL菌种保藏管中,将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后,于-20℃冰箱中保存。

 

信息来源:https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU0Mzk3MDY5MQ==&mid=2247511290&idx=1&sn=e858545067beb66f3bb98db6c3fd1139&chksm=fb01a816cc76210000635e75ffd6d62ec3385d7b3f1b0583b805ccdbef58f1e7786e6d761c7f&mpshare=1&scene=1&srcid=1214gsJxicXUCVLBRNd2MuUf&sharer_sharetime=1607944843849&sharer_shareid=53c00c5aea8d273370e0b8e1fc31a74e&key=7e19afe4bc32aaec6d6e1a91e0fbc71a9a5083a2a2d1c9a47ad998c41f37569f13e101bc4a3af8cf1ffd400df4dc83f7c404a9be4c93810ffaca45a5f798a2cfe1876478adaaffa1d71aa01ce0bb0cee883949fa5e13fb6356cbc091c2afb33c0858665f3e44e4015cc76fb5296d6f2e2918a9bfaf6fa5ce9e3ccdddf072ad5a&ascene=1&uin=MTEzMjI3MTcwMw%3D%3D&devicetype=Windows+7&version=62080079&lang=zh_CN&exportkey=AQHqnFdhIXh9YDjXxc6EUXM%3D&pass_ticket=jPoc%2BLkMnT1ciHmY3LWvnYmDMsypG4hV9prHHn56Y9yieytglRg%2BFnCIfxK3VjRQ&wx_header=0